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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12746 (2022) Citer cet article

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La caractérisation holographique totale (THC) est présentée ici comme une méthode efficace, automatisée et sans étiquette pour identifier avec précision la viabilité cellulaire. Le THC est une technologie de caractérisation de particules uniques qui détermine la taille et l'indice de réfraction des particules individuelles à l'aide de la théorie de Lorenz-Mie sur la diffusion de la lumière. Bien que l’évaluation de la viabilité cellulaire constitue un défi dans de nombreuses applications, y compris la fabrication de produits biologiques, les approches traditionnelles incluent souvent un étiquetage peu fiable avec des colorants et/ou des méthodes chronophages de comptage manuel des cellules. Dans ce travail nous avons mesuré la viabilité de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence de différentes concentrations d'isopropanol en fonction du temps. Toutes les mesures de THC ont été effectuées dans l’environnement natif de l’échantillon, sans dilution ni ajout de marqueurs. Les mesures holographiques ont été effectuées avec un microscope holographique en ligne utilisant un objectif 40\(\times\) avec éclairage par ondes planes. Nous avons comparé nos résultats avec le THC au comptage manuel des cellules vivantes et mortes, distingué par le colorant bleu trypan. Nos résultats démontrent que le THC peut distinguer efficacement les cellules de levure vivantes et mortes grâce à l'indice de réfraction des cellules individuelles.

L’utilisation de cellules de levure, en particulier de Saccharomyces cerevisiae, est omniprésente tant dans l’industrie que dans le monde universitaire1,2,3 pour des applications allant des expériences cellulaires à la fabrication de protéines. Par exemple, dans la recherche médicale, la levure sert d’organisme modèle pour étudier les mutations génétiques pertinentes dans le cancer4,5,6. Dans la recherche et la fabrication biopharmaceutiques, les cellules de levure sont utilisées comme mini-usines pour la production de protéines d’intérêt7,8,9. De plus, dans l’une des applications les plus connues, la levure est utilisée dans la recherche et la fabrication de produits de consommation afin d’optimiser la fabrication de la bière, du vin et du pain10,11,12,13.

La viabilité cellulaire est un paramètre clé d’intérêt dans bon nombre de ces applications14. Bien qu'il existe de nombreuses méthodes de mesure de la viabilité de la levure, la plupart partagent une limite : la nécessité de colorer les cellules avec un colorant. Les méthodes basées sur les colorants, telles que le test d’exclusion au bleu trypan (TB), reposent sur le fait que les membranes des cellules saines sont imperméables au colorant, tandis que les membranes des cellules mortes ou endommagées permettent au colorant de se diffuser dans la cellule15. Bien que cette méthode soit utile, elle implique généralement une préparation fastidieuse des échantillons et un comptage manuel des cellules. Le comptage manuel des cellules souffre de faibles statistiques et est sujet aux erreurs humaines. En outre, il a été démontré que le test d'exclusion de la tuberculose surestime la viabilité et n'est pas fiable pour certains échantillons de cellules dont la viabilité est inférieure à 70 % à 80 %16,17,18.

De plus, avec toute mesure de viabilité de coloration basée sur un colorant, il existe un risque que le colorant puisse interagir de manière involontaire avec les cellules ou avec une autre variable expérimentale. À titre d’exemple, il a été démontré que le bleu trypan interagit de manière négative avec les cellules, les rompant souvent et rendant ainsi les mesures de viabilité peu fiables19. Bien que les inconvénients des tests de viabilité basés sur l’étiquetage soient bien connus, il existe peu d’alternatives sans étiquette20.

Dans ce travail, nous introduisons une technique automatisée et sans étiquette pour mesurer de manière fiable la viabilité de la levure à l’aide de la Total Holographic Characterization® (THC). Le THC est une technologie basée sur la microscopie vidéo holographique, développée pour détecter, compter et caractériser les particules subvisibles en suspension21. Ici, nous avons évalué la viabilité de la levure à l'aide de xSight, qui met en œuvre le THC et combine la microscopie holographique avec la manipulation d'échantillons microfluidiques pour fournir des mesures précises de la taille des particules et de l'indice de réfraction. L’utilisation de puces d’échantillons microfluidiques à usage unique garantit qu’il n’y a pas de contamination croisée entre les échantillons et qu’aucun nettoyage n’est requis. Chaque mesure est automatisée et prend environ 15 minutes.